【First-in-class药设系列】蛋白质靶向降解技术的新发展

  蛋白质的靶向降解(Proteolysis Targeting Chimeras，PROTACs)技术是一项近年来蓬勃兴起、并在学界和工业界均获得广泛关注的新技术。PROTAC分子是一种由双功能杂合小分子(heterobifunctional molecule)，由三个部分组成：1)可靶向目标蛋白(proteinof interest， POI)的小分子配体；2) 可连接E3泛素连接酶的捕获体；3) 连接上述两部分的linker。在体内，PROTAC分子可将目标蛋白与E3泛素连接酶连接，形成三元复合物，从而使目标蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解。与传统的“占位驱动”(occupancy driven)模式不同，PROTAC分子不需要长时间地占据蛋白质的功能位点来抑制蛋白的功能活性，因此具有用量小、毒性低、不易产生耐药性等优点，还可靶向传统概念中难以成药的蛋白。特别值得注意的是，由Arvinas公司研发的第一个口服PROTAC药物ARV-110已成功进入临床I期阶段。

  鉴于PROTAC广阔的应用前景，其方法学研究也逐渐被大家所关注，近年来多项基于PROTAC的技术改造不断涌现。北京大学的潘峥婴课题组提出了一种新的PROTAC思路：利用光的时间分辨率和空间分辨率，开发一种利用光来控制蛋白质降解的方法。该研究以前期研究较多的dBET1为研究对象，拟通过向其引入光控基团调节其对Brd4蛋白的降解活性。

  首先，研究者根据目标蛋白Brd4与其配体JQ1、E3连接酶CRBN与其配体沙利度胺(thalidomide)的晶体结构，设计了两个光控PROTAC分子：pc-PROTAC1和pc-PROTAC2，分别可阻断该PROTAC分子与Brd4或CRBN的连接。然而，在365 nm的光解实验中，仅pc-PROTAC1可有效地生成目标分子dBET1 (产率：50%，t_1/2=60 s)，且在避光状态下pc-PROTAC1可稳定存在，因此选取pc-PROTAC1进行进一步地研究。

  如图a所示，与JQ1 (IC₅₀=71 nM)和dBET1(IC₅₀=22 nM)相比，pc-PROTAC1 (IC₅₀=7.6 μM)对Brd4分子的亲和力显著下降了约100倍。随后，作者采用Ramos细胞对pc-PROTAC1的活性进行了验证。结果(图b, c)表明，在光照的条件下，pc-PROTAC1对Brd4的降解活性呈现出明显的计量依赖性和时间依赖性，且0.3 μM pc-PROTAC1的活性与0.1 μM dBET1的活性相当。在1 μM的浓度下，pc-PROTAC1可几乎完全降解目标蛋白Brd4 (最大降解率可达93%)。当pc-PROTAC1在避光状态下与细胞共同孵育2小时后，即使用新鲜培养基洗掉体系中游离的pc-PROTAC1，在恢复光照后Brd4蛋白仍可发生降解。进一步，作者采用Namalwa细胞和HUH7细胞对pc-PROTAC1的活性进行了验证。结果表明，pc-PROTAC1可显著抑制Namalwa细胞的增殖(图d)，且在5 μM的浓度下可几乎完全抑制HUH7细胞的克隆形成(下图e)。上述实验结果表明，pc-PROTAC1可在紫外光存在的情况下显著降解细胞中的Brd4蛋白，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

  斑马鱼胚胎模型是一个广泛应用于药物研发领域的动物模型。考虑到斑马鱼中E3泛素连接酶CRBN的基因序列与人类高度相似，且Brd4在斑马鱼胚胎早起形成过程中广泛表达。为验证pc-PROTAC1的体内活性，作者采用受精后12小时(hpf)的斑马鱼胚胎进行实验。在光照的条件下，100μM的pc-PROTAC1可减少斑马鱼胚胎卵黄的形成，其卵黄在36 hpf几乎完全消失，其趋势与dBET1完全一致。与此同时，Western Blot实验和荧光实验均表明，斑马鱼胚胎中Brd4水平在被pc-PROTAC1处理后显著下降，进一步证实了pc-PROTAC1在斑马鱼体内的活性。在这些工作的基础上，研究人员还在另一个PROTAC分子MT-802的基础上构建了一个新的光控PROTAC分子(pc-PROTAC3)。在光照的条件下，pc-PROTAC3可显著降低蛋白BTK的水平，其活性与MT-802类似，表明该技术可应用于不同蛋白质的降解。上述研究不仅增加了PROTAC分子的可控性，也为PROTAC分子的设计和未来的应用提供了新的思路。

  相比之下，来自加州大学伯克利分校的Daniel Nomura教授课题组则从另一个方面对PROTAC技术进行了扩展。人类基因组中有超过600种E3泛素连接酶，但目前仅有少数的几种连接酶及其捕获体被应用到了PROTAC分子的设计中。在研究中，该课题组对一个具有广泛研究基础的天然产物nimbolide进行了化学生物学研究。作者在文献调研的基础上，选取对多种肿瘤细胞都具有良好的抗肿瘤作用的柠檬苦素类化合物nimbolide作为研究对象，通过isoTOP-APBB的方法确认了该化合物抑制乳腺癌细胞231MFP增殖的主要靶点的RNF114 (一种已知的E3泛素连接酶)。进一步的研究表明，nimbolide并不能影响RNF114的催化活性，而是通过共价键的方式作用于其底物p21 (一种肿瘤抑制因子)的底物识别位点C8，通过抑制p21的泛素化进而抑制肿瘤细胞的增殖。考虑到化合物可共价地与E3泛素连接酶RNF114的底物识别位点结合，作者提出一种假设：是否可将nimbolide开发成一种新的E3泛素连接酶捕获体？随后，作者将该化合物与JQ1进行连接，设计了一个新的PROTAC小分子XH2，并验证了其对Brd4蛋白的降解活性。最后，作者采用结构简化的方法，获得了结构更简单、更易获得的E3泛素连接酶捕获体EN62。该研究不仅明确了天然产物nimbolide对肿瘤细胞的作用靶点及作用机制，更为PROTAC的设计提供了新的E3泛素连接酶捕获体片段。

展望：

目前，PROTAC技术已经成为药物研发的新策略。随着PROTAC应用范围的扩大，其技术领域的创新仍有待进一步的探索。除了增加其可控性和适用性外，PROTAC技术还面临着许多其它的问题，如：PROTAC分子的活性高度依赖于“目标蛋白-PROTAC分子-E3泛素连接酶”三元复合物的稳定性，而该分子的设计过程大多只参考了目标蛋白与泛素连接酶和各自配体形成的“二元复合物”的稳定性。如何更早地将三元复合物的稳定性纳入考察范围？此外，多数PROTAC分子的透膜性和溶解性较差，导致其药代动力学性质不佳，这也是目前PROTAC分子难以成药的一个主要技术问题。然而，随着越来越多PROTAC方法学的研究的开展，相信该技术在未来的制药领域中会发挥越来越重要的优势。

参考文献：

1.    Xue,G.; Wang, K.; Zhou, D.; Zhong, H.; Pan, Z. Light-Induced Protein Degradationwith Photocaged Protacs. J. Am. Chem.Soc. 2019, 141, 18370–18374.

2.    Spradlin,J. N.; Hu, X.; Ward, C. C.; Brittain, S. M.; Jones, M. D.; Ou, L.; To, M.;Proudfoot, A.; Ornelas, E.; Woldegiorgis, M.; Olzmann, J. A.; Bussiere, D. E.;Thomas, J. R.; Tallarico, J. A.; McKenna, J. M.; Schirle, M.; Maimone, T. J.;Nomura, D. K. Harnessing the Anti-Cancer Natural Product Nimbolide for TargetedProtein Degradation. Nat. Chem. Biol. 2019, 15, 747–755.

3.    Pettersson,M.; Crews, C. M. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) – Past, Present andFuture. Drug Discov. Today Technol. 2019, 31, 15–27.